Ақуыздың бастапқы құрылымын анықтау

Ақуыздың құрамындағы аминқышқылдардың орналасу ретін анықтау жолы классикалық биохимияның стандартына сай, әдеттегі әдіс болғанмен қарапайым жұмыс емес. Дұрыс нәтижелер алу үшін, бұл әдісті мұқият орын- дау керек (5.14-сурет). Ақуыздың бастапқы құрылымын анықтаудағы ең алғашқы 1-кезеңде қандай аминқыш қылдар бар екендігі және олардың әрқайсысы қандай үлес құрайтыны анықталады. Ақуызды құрамдас бөліктеріне дейін, яғни, аминқыш қылдарға дейін ыдыратып бұзу қиын емес: пептидтік байланы- старды гидролиздеу үшін ақуыз ерітіндісін қышқылға салып қыздырады, бұл мақсатта әдетте 6М НСІ қышқылын алып, оны 100 °С бастап 110 °С дейін, 12-36 сағат аралығында қыздырады. Өнімдерді құрамдас бөліктерге ажыратып, оларды жеке түрде анықтау айтарлықтай қиын және күрделі жұмыс, оны аминқыш қылдық анализатордың көмегімен жасаған дұрыс. Бұл автоматтандырылған құрал бізге екі түрлі мәлімет бере алады: біріншісі — өнімнің құрамында қандай аминқышқылдар кездесетіні туралы сапалы мәлімет; екіншісі — әрбір аминқышқылының салыстырмалы түрдегі мөлшері жайында. Аталған құрал тек аминқышқылдарды сараптап қана қоймай, әрі қарай сиквенстеу (анықтау) үшін қандай үдерістерді таңдау керек екендігі ту- ралы шешім қабылдауға мүмкіндік береді (5.14-суреттегі 3 және 4 кезеңдерді Биохимия 2 0 7 қараңыз). А минқыш қылдықанализатор аминқыш қылдардан тұратын қоспаны ион алмасты руш ы хроматография арқы лы немесе аса ти ім д і сүйықтықты хр о м а то гр а ф и я н ы ң (АТСХ) көмегімен бөліп, ажыратады . 5.15-суретте осы техниканы ң көмегімен аминқыш қылдарды бөлу нәтижесі көрсетілген. 2-кезеңде, ақуы зды ң құрамы ндағы ам и н қы ш қы лды қ тізбектің Ы -соңы мен С -соңы ан ы қталады . Қазіргі уақы тта жеке пептидтерді сиквенстеу жұмысы кемелдендіріліп ж атқанды қтан, бұл кезеңнің қаж еттілігі ш амалы. Дегенмен, бұл әдісті ақуы зды ң құрамы бір әлде екі полипептидтік тізбектен тұратындығын тексеру үшін пайдалануға болады. 3- ж ән е 4 -к е зе ң д е р д е , ақ у ы зд ы ұ сақ б ө л ш ек тер ге б ө л іп , о н ы ң ам и н қы ш қы л ды қ тізбегінің реттілігін аны қтайды . А втоматтанды ры лған құрал ақуыздардың ам инқы ш қы лды қ құрамын басқа жолмен де сиквенсте- уге (анықтауға) м үмкіндік береді, атап айтқанда ам инқы ш қы лды қ тізбектің тізбекті әрқайсысы 20- 50 аминқыш қыл қалдығынан тұратын қысқа бөліктерге бөліп алу керек. АҚУЫЗДЫ ПЕПТИДТЕРГЕ ДЕЙІН ЫДЫРАТУ Ақуыздарды олардың арнайы аймақтарына ферменттер немесе химиялық реагенттер арқылы әсер ету жолымен ыдыратуға болады. Трипсин ферменті, негізінен алғанда лизин және аргинин сияқты оң зарядты К. топтардан тұратын аминқыш қылдарының арасындағы пептидтік байланыстарды ыдыратады. Бұл жағдайда, ыдыраудың нәтижесінде түзілетін пептидтердің біреуінің С-соңында аталған топқа жататын ам инқы ш қы лды ң зарядталған бүйірлік тізбегі жата- ды (5.16-сурет). Бастапқы, ыдырамаған күйдегі ақуыздың С-соңын құрайтын аминқыш қыл кез-келген 20 аминқыш қылдың біреуі болуы мүмкін және ыды- рау тек белгілі бір аминқы ш қы лдан бастап жүруі шарт емес. Егер ақуыздың бастапқы тізбегінің С-соңын құрайтын аминқыш қыл ыдырау аймағы ретінде болмаса, онда осы бастапқы тізбектің С-соңы бойынша анықталатын пептид автоматты түрде табылады. Х имотрипсин деп аталатын басқа фермент көп жағдайда тирозин, трип- тофан және ф енилаланин сияқты ароматтық қатарға жататын ам инқы ш — қылдардың арасындағы пептидтік байланыстарды бұзады. Бұл жағдайда, ыды- рау реакциясы ны ң нәтиж есінде қалатын пептидтердің С-соңы ароматтық қатарға жататын аминқыш қылымен аяқталады (5.17-сурет). Бромциан (СИВг) деп аталатын химиялық реагент болған жағдайда, ыды- рау аймағы ретінде ішкі метионин қалдықтары болып табылады. М етиониннің құрамындағы күкірт бромцианның құрамындағы көміртегімен әрекеттеседі, нәтиж есінде пептидтік бөліктің С -соңы нда гомосеринді лактон түзіледі (5.18-сурет). Ақуыздардың жоғарыда аталған қосылыстар әсерінен ыдырауы нәтижесінде көптеген пептидтердің қоспасы алы нады , түрлі пептидтерден тұраты н қоспа ны әрі қарай аса тиімді сұйықтықты хроматография арқылы бөледі. Қорыта айтқанда, сиквенстеу үшін ақуыздың үлгілерін әртүрлі реагенттер- мен өңдейтін болсақ, оның нәтижесінде түзілетін қоспалар да әртүрлі бола- ды. Бір реагенттің әсер етуінен құралған пептидтер жиынтығының тізбектері, басқа реагенттің ықпалынан құралған тізбектердің үстін басады (5.19-сурет). Нәтижесінде, пептидтердің орналасу реті олардың әрқайсысының өзіне тән ам инқы ш қы лды қ реттілігі анықталғаннан кейін дұрысталады. ПЕПТИДТЕРДІ СИКВЕНСТЕУ: ЭДМАН ӘДІСІ А қуызды арнайы ыдырату арқылы алы наты н әрбір пептидтің нақты ам и н қ ы ш қ ы л д ы қ құрам ы н ан ы қтау үш ін Э дм анн ы ң д еград ац и ялау әдісі қайталамалы түрде қолданылады. Бұл әдістің көмегімен 10-40 дейін ам инқы ш қы лды қ қалды қтардан тұратын пепидтік тізбектің реттілігін 30 минут іш інде анықтауға болады. Ол үшін зерттеу материалы тек 10 пмоль мөлшерде алынады, оның себебі ақуыз бөлігінің таза күйіндегі мөлшеріне және тізбектің құрамын анықтау өте күрделі екендігіне байланысты. Мысалы, пролинді анықтау серинді анықтауға қарағанда айтарлықтай қиын, өйткені пролиннің реакцияға түсу белсенділігі жоғары болып келеді (5.19-суретте көрсетілген жеке пептидтердің құрамындағы амин қышқылдардың орнала- су реті пептидтерді бір-бірінен ажыратып, бөліп алғаннан кейін Эдман әдісі бойынша анықталады). Әртүрлі реагенттермен өңделген пептидтік тізбектер бірінің үстінде бірі жатады, реагенттердің әртүрлі болуы араласып жатқан тізбектерді шатастырмай, дұрыс табуға мүмкіндік беретін кілт ретінде бола алады. Әртүрлі пептидтерде бірдей немесе ұқсас тізбектердің кездесуі тізбектің құрамын толық түрде дұрыс тауып анықтауға мүмкіндік береді. Эдман әдісінің тиімділігі өте жоғары болғандықтан, әрі қарай ақуыздың ІЧ-соңы мен С-соңын химиялық немесе ферменттік әдістердің көмегімен анықтап, сәйкестендірудің қажеті жоқ. Алайда, алынған нәтижелерге сипаттама беру барысында ақуыздың құрамы кейде бір емес бірнеше полипептидтік тізбектерден тұруы мүмкін екендігін ескерген жөн. Пептидтің құрамын анықтау үшін, фенилизотиоцианат деп аталатын Эд- ман реагенті пептидтің Ы-соңындағы аминқышқыл қалдығымен әрекеттеседі. Бұл реакцияны ң нәтижесінде өзгеріске ұшыраған ам инқы ш қылы (Ы- соңындағы) пептидтік тізбектен ажырайды да, тізбектің қалған бөлігі ин- тактты (өзгермеген, бүтін) күйде болады. Тізбектен бөлінген аминқышқылы фенилтио-гидантоиндік (ФТГ) туынды ретінде анықталады. Сонан соң, бастапқы пептидтен қалған тізбектегі екінші аминқышқылы да осы жолмен өңделеді, келесі кезекте үшінші аминқышқылы дәл солай өңделіп, ажыраты- лады. Секвенатор деп аталатын автоматты құралда (5.20-сурет) аталған үдеріс пептидтің құрамы толық анықталмағанша қайталана береді. Сиквенстеу әдісінің басқа түрі келесі қағидаға сүйенеді: белгілі бір ақуызға жауап беретін гендегі ДНҚ-ың нуклеотидтік тізбегін ақуыздың ам инқы ш қы лды қ тізбегіне қарай отырып анықтауға болады. Заманауи әдістерді пайдаланудың арқасында, кей жағдайларда, ДНҚтізбегінің құрамы мен реттілігін анықтау ақуыздың аминқыш қылдық құрамын анықтауға қарағанда оңай. Генетикалық код белгілі болса, онда сол код бойынша ақуыздың қандай аминқышқылдардан тұратынын бірден анықтауға болады. Бұл әдіс өте ыңғайлы болғанмен, ол арқылы аминқышқылдардың арасында кездесетін дисульфидтік байланыстардың орналасқан жерін анықтай алмай- мыз, сонымен қатар, трансляция үдерісінен кейін әдетте өзгеріске ұшырайтын гидроксипролин сияқты аминқышқылдарды аталған әдіспен анықтау мүмкін емес. Оның үстіне, ақуыздың синтезделуге жіберілетін соңғы нұсқасы қалыптасқанға дейін эукариоттық геномда жүретін қарқынды үдерістер мұнда есепке алынбайды. Осы бөлімді түйіндей отырып, не үшін ақуызды ұсақ бөлшектерге бөлу керек екендігіне қайта оралайық. Аминқышқылдық анализатор бізге кез-келген тізбектің құрамын анықтап беретінін есепке ала отырып, 100-аминқышқылынан тұратын ақуыздың құрамын осы құралда талдаған дұрыс және оңай сияқты көрінеді. Өйткені, мұнда трипсин, хи- мотрипсин немесе басқа да химиялық қосылыстар арқылы ақуызды өңдеп, Биохимия 213 бөлшектерге кесудің қажеттілігі жоқ. Дегенмен, біз Эдман әдісінің техникалық шамасы мен м үм кіндіктерін ескеруге тиістіміз. 5.20-суреттің 1 кезеңінде көрсетілгендей, біз пептидті Эдман реагентімен, яғни фенилизотиоцианат- пен (ФИТЦ) әрекеттестіреміз. Бұл үдерістің стехиометриялық тепе-теңдігі бойынш а реакцияға бір молекула пептид пен бір молекула Ф ИТЦ қатысады. Нәтижесінде, реакция үшінші кезеңге жеткенде ФТГ туындысының бір моле- куласы түзіледі. Сонан соң, бұл түзілген қосылыс арнайы жолмен анықталады. Өкініш ке орай, стехиометриялық тепе-теңдікті сақтау өте киын. Мысалы, біз Азр—Ьеи—Туг және т.б. аминқыш қылдарынан тұратын пептидтік тізбекті тал- даудамыз деп санайық. Түсінікті болу үшін, біз 100 молекула пептидті ФИТЦ- тің 98 молекуласына қосамыз делік (себебі, біз аталған екі қосылыстың сандық мөлшерін нақты өлшей алмаймыз). Бұл жағдайда не байқалады? Бірінш і кезеңде Ф ИТЦ шектеулі болады, сондықтан ол аспартаттың ФТГ туындысы 98 молекулаға жеткенде аяқталады. соңында аспартат болатыны белгілі, сол үшін ол дұрыс анықталады. Реакцияның екінші айналымында, біз ФИТЦ көбірек қосамыз, бірақ, мұнда енді екі пептид бар; олардың 98 лейциннен ба- сталады, ал 2 аспартаттан басталады. 2-ші кезеңнің ФТГ туындысын сарап- тау барысында біз екі сигнал аламыз, біреуі лейциннің туындысын білдірсе, екінш ісі — аспартаттың туындысын білдіреді. 2 кезеңде, аспартаттық ФТГ туындысының аз мөлшерде болуы екінші аминқыш қылын анықтауға кедергі келтірмейді. Бірақ, аталған реакция қайталанған сайын олардың нәтижесінде түзілетін өнім де көбейе береді және бұл жағдай сиквенстеудің сапасына кері әсерін тигізе бастайды. Белгілі бір уакыттан кейін, ФТГ туындыларын талдау бойынша аминқышқылдарды нақты анықтау мүмкіндігі жоғалады. Сол себеп- тен, біз ақуыздың құрамын анықтауды қысқа пептидтік тізбектерден бастауы- мыз қажет. Бұл олардың құрамындағы аминқышқылдарды сигнал жоғалғанға дейін анықтап алуға мүмкіндік береді.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *