Клеткалардан таза ақуыздарды бөліп алу

Әрбір жеке дара клеткада көптеген және алуан түрлі ақуыздар кездеседі. Кез-келген ақуыздың қасиеттерін толыққанды зерттеу үшін тек бір түрге жататын молекулалардан тұратын, гомогенді зерттеу үлгісі қажет. А қуы здарды ж екеленген күйде бөліп алы п, оқш ауландыру немесе оларды әртүрлі қоспалардан тазалау — ақуыздарға жасалатын барлық тәжірибелердің ең бірінші және ең маңызды қадамы болып табылады. Ж алпы алғанда, ақуыздарды бөліп алу техникасы олардың көлеміне, зарядты лы ғы на ж әне п олярлы қ қасиеттеріндегі ерекш еліктерге негізделген. А қуыздарды ң алуан түрлі болуы ны ң негізгі себебі осы аталған қасиеттерге байланы — сты. Көптеген техникалар біз көздеген ақуызды түрлі қоспалардан аж ы раты п, оны ң таза күйдегі үлгісін бөліп алу үшін қолданылады. Бұл тәжірибе бары сы нда тазалау ж ұм ы сы н ы ң қ алай ж үзеге асып ж атқаны н бағалау үш ін, ақуыздардың қайта қалпы на келу қасиетін және қоспасыз болуы мен тазалы ғы н көрсететін кесте ж асалады. 5.1-кестеде ферменттің тазалану көрсеткіші берілген. Қалпына келу қасиетін пайы зды қ түрде көрсететін бағана арқы лы тазалауды ң әрбір кезең ін де ақуы зды ң қанш а пайызы сақталғаны н қадағалауға болады. Тазалау барысында бұл көрсеткіш әдетте төмендеп отырады, сондықтан аталған тәжірибе ақуыз толы қ тазартылған уақытта қалатын ақуыздың пайыздық мөлшері оны зерттеп, толы ққанды сипаттама беру- ге жеткілікті болады деген үмітпен жасалады. Арнайы белсенділік қасиетін көрсететін бағана бой- ы нш а тазалаудың әрбір кезеңіндегі ақуыздардың тазарғандылық дәрежесін салыстыруға болады және тазалау сәтті болған жағдайда, бұл көрсеткіш жоғарылауы керек. Клеткалардан ақуыздарды қалай бөліп алуға болады? Ақуыздардың тікелей тазалану кезеңдерін бастаудан бұрын ақуыздарды клеткалардан және субклеткалық органоидтардан бөліп алу керек. Гомогени- зациялау деп аталатын ең алғашқы кезеңде клеткалар бұзылып, бөлшектенеді. Бұл әртүрлі әдістердің көмегімен жасалуы мүмкін. Ең қарапайым тәсіл — ұлпаны арнайы езгіште (блендерде) өзіне сәйкес келетін буфермен қоса ұсақтау. Клеткалар бұзылған жағдайда, ерігіш ақуыздар сыртқа шығады. Сондай-ақ, бұл үдерістің нәтижесінде митохондрия, пероксисома және эндоплазмалық тор сияқты көптеген субклеткалық органоидтар да бұзылады. Клетка құрылымын ұқыпты сақтай отырып өңдеу үшін қабырғасы қалың, сынақтүтігінен тұратын РоНег-Еһеһіет гомогенизаторы пайдаланылады. Оның жуан қабырғалы түтігі арқылы онымен тығыз жанасқан поршень (немесе итергіш піспек) өтеді. Піспектің айналасындағы гомогенаттардың қысылуынан клеткалар жарыла- ды, алайда көптеген органоидтар бүтін күйінде сақталады. Сонымен қатар, ультрадыбыстық деп аталатын басқа да әдіс бар. Бұл әдісте клеткаларды бұзу үшін дыбыстық толқындар қолданылады. Клеткаларды сондай-ақ, мұздату және еріту жолымен де бұзуға болады. Егер ақуыз мембранаға қатты жабысып қалса, ақуыздарды ажыратып алу үшін еріткіштер қосылуы мүмкін. Клетка- ларды гомогенизациялағаннан кейін, оларды дифференциалды түрде центрифугалау қажет.

Зерттеу үлгісін центрифугада 600 рет айналдыру барысында, тартылыс күшінің (600 х ё) әсерінен клеткалар мен ядролар тығыз түйіршіктерге айна- лады. Егер ядролардан біз көздеген ақуыз табылмаса, онда мұндай тұнба жарамайды және ол тасталады. Митохондрияны тұнбаға тұсіру үшін тұнбаның үстіндегі сұйықтық немесе супернатант аса жоғары жылдамдықта, мысал үшін 15000 х § айналымда центрифугаланады. Кейіннен, 100000 х§айналымдацен- трифугалау арқылы рибосомалар мен мембрана бөлшектерінен тұратын ми- кросомалды фракция тұнбаға түсіріледі. Егер біз көздеген ақуыз ерігіш бол- са, онда осы центрифугалаудан алынатын супернатантты ыдысқа жинайды. Бұл сұйықтықты жартылай тазартылған деуге болады. Өйткені ол ядролар мен митохондриялардан әлі де болса тазаланған жоқ. 5.1-суретте дифферен- 192 5-ТАРАУ Ақуыздарды тазалау және оларды сипаттау техникасы циалды центрифугалаудың көмегімен бүтін клетканы бөлшектерге ажырату көрсетілген. Ақуыздар суда еритін күйге жеткеннен кейін, оларды көп жағдайда ерігіштік қасиетіне байланысты бөліп, жартылай тазартады. Бұл әдіс тұздардың көмегімен ақуыздарды тұнбаға түсіру деп аталады, және мұнда ең кеңінен қолданылатын реагент — аммоний сульфаты болып табылады. Әдістің негізінде суда ерігіш ақуыздар мен тұздардың сумен байланыс түзуге бәсекелестігі жа- тыр. Полярлы және ионды косылыстарда ақуыздардың ерігіштік қасиеті өзгеріп отырады. Сумен өзара байланыс түзуінің нәтижесінде ерітіндідегі ақуыздардың ерігіштік қасиеті сақталады. Ақуыз ерітіндісіне аммоний суль- фатын қосқан жағдайда, судың біршама мөлшері тұздармен ион-дипольды әрекеттесуге жұмсалады, яғни, ақуыздың құрамындағы судың байланысқан түрі біршама сыртқа шығады. Судың мөлшері ақуыздардың толыққанды ги- дратациялануына (сумен қанығуына) жеткіліксіз болған уақытта, ақуыздар өзара, яғни бір бірімен гидрофобты байланыстар арқылы әрекеттесе бастай- ды. Ерітіндідегі аммоний сульфатының белгілі бір мөлшері тұнбаға түседі. Тұнбаның құрамында ақуыздардың қоспасы болады. Тұнбаны мұндай акуыз қоспаларынан тазарту үшін центрифугаға салады. Сонан соң, тазаланған тұнбаның үстіне тағы тұз қосылып, басқа да әртүрлі ақуыздар тұнбаға түсіріледі. Осылайша, біз көздеген ақуыздың тұнбасы алынады. Бізге қажетті ақуыздың тұнбасын центрифугалағаннан кейін ыдысқа жинап, сақтайды. А м м оний сульф аты н қан ш а мөлш ерде алу керектігін білу үш ін, оны ң 100% қан ы ққ ан ерітінді жасауға кететін үлесімен салы сты — ру қажет. Әдетте, ерітіндінің қаны ққанды лы қ дәрежесін шамамен 40% жеткізеді де, оны цен- трифугада айналды ры п, тұнбаға түсіреді. Со- нан соң, супернатантқа қосымш а түрде аммо- ний сульфатын салады және көп жағдайда, бұл кезеңде ерітіндінің қаны ғу дәрежесі 60-70% дейін жеткізіледі. Бұдан түзілетін тұнбаны ң құрамында бізге қажетті ақуыз да болады. Ж ал- пы алғанда, аталған әдістер алды н-ала өңдеу үшін қолданылатын болғандықтан, бұл жолмен алынатын зерттеу үлгісі та- за күйде болмайды, дегенмен, аталған шаралар өңделмеген ірі гомогенатты тереңінен және тиімді түрде зерттеуге даярлау үшін маңызды қызмет атқарады.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *