Ферменттердің белсенділігін анықтау

Фермент — лат. fermentum — ашытқы; знзим — грек тіл. эн — ішкі, қысқа — ұйытқы.

Ферменттер немесе энзимдер — бұл катализаторлар ақуыз табиғат, пайда болған және қызмет ететін барлық тірі организмдер. Шығу тегі терминдер бұл бастапқыда ферментативтік процестер ашылып, зерттелді, ашыту өндірісінде. Әрбір торда бар жүздеген әр түрлі ферменттер. Олардың көмегімен жүзеге асырылады көптеген химиялық реакциялар, олар үлкен жылдамдықпен жүре температураларда үшін қолайлы осы организмнің, яғни шегінде 5-тен 40 0 С. Бұл реакция сол жылдамдықпен жүргізілгені ағзадан тыс, талап етілген еді жоғары температура мен күрт өзгеруі кейбір басқа да жағдайлар. Үшін жасушалар бұл мағынаны еді жойылуы, себебі барлық жұмыс жасушалары құрылады болдырмайтындай кез-келген қандай-да бір елеулі өзгерістер қалыпты жағдайында оның өмір сүру. Демек, ферменттер анықтауға биологиялық катализаторлар, яғни заттар, бояуды реакция. Олар мүлдем қажет, өйткені оларсыз реакция жасушаларында жүргізілгені тым баяу емес еді қолдау. Жиынтығы биохимиялық реакциялардың катализируемых ферменттерге, мәнін құрайды зат алмасу болып табылатын басты ерекшелігі, барлық тірі организмдер. Арқылы ферментативный аппараты, реттеу, оның белсенділігін жүреді және реттелуі метаболиттік реакциялардың жылдамдылығын, олардың бағытта.

Бола отырып, катализаторы, ферменттер бар бірқатар жалпы с небиологическими катализаторы қасиеттері:

1. Ферменттер құрамына кірмейді, соңғы реакция өнімдерінің шығады, оған, әдетте, оның бастапқы түрінде, т. е. олар жұмсалады процесінде катализ (қазіргі уақытта дәлелденсе, кейбір ферменттер соңында химиялық реакция ұшырайды түрлендіру және тіпті ыдырауға емес, босатылады өзгермеген түрде, постулировал Л. Михаэлис).

2. Ферменттер мүмкін емес қозғауға сол реакцияның ағуы оның заңдарына қайшы келсе, термодинамика, олар жылдамдатады ғана реакция мүмкін өтуі.

3. Ферменттер жоқ смещают ережелер тепе-теңдікті, ал ғана тездетеді, оның жетістік.

Ерекше қасиеттері:

1. Әрине, өзінің химиялық құрылысы барлық ферменттер болып табылады ақуыз.

2. Тиімділігі ферменттер қарағанда жоғары небиологических катализаторлар (реакцияның өту жылдамдығы қатысуымен ферментінің жоғары бірнеше ретті).

3. Ферменттер-өрісі тар спецификалы, избирательностью қолданылу субстраты, яғни заттар, айналдыру, олар катализируют. Жоғары сезімталдығы ферменттер негізделген конформационной және электростатикалық комплиментарностью арасындағы молекулалар субстрат және ферментінің және бірегей құрылымымен белсенді орталығының ферментінің қамтамасыз ететін «тану», жоғары сродство және таңдау ағу бір қандай да бір реакция мың басқа химиялық реакциялардың жүзеге асырылатын бір мезгілде тірі жасушаларында.

Тәуелді ету механизмін ажыратады ферменттер салыстырмалы (немесе топтық) спецификалы және абсолютті спецификалы. Сонымен, іс-әрекет үшін кейбір гидролитических ферменттер ең үлкен мәні бар түрі химиялық байланыс молекуласындағы субстрат. Мысалы, пепсин расщепляет белоктар жануарлар мен өсімдіктерден алынған, дегенмен олар айтарлықтай бір-бірінен ретінде химиялық құрылымына және аминқышқылды құрам, сондай-ақ физикалық-химиялық қасиеттері бойынша. Алайда, пепсин емес расщепляет көмірсулар немесе майлар. Бұл қолданылу орны пепсина болып табылады пептидтік -СО-NH — байланыс. Іс-әрекет үшін липаза, катализирующей гидролизі тоң глицерин және май қышқылдары, мұндай орын болып табылады сложноэфирная байланыс. Ұқсас салыстырмалы спецификалы ие, сондай-ақ, кейбір внутриклеточные ферменттер, мысалы, гексокиназа, катализирующая қатысуымен АТФ фосфорлану барлық дерлік гексоз, дегенмен бір мезгілде жасушаларында бар ерекше әр гексозы ферменттер орындайтын осындай фосфорлану.

Абсолюттік спецификалы әрекет деп атайды қабілеті ферменттің катализировать айналдыру тек жалғыз субстрат. Кез келген түрлендіру құрылымы субстраттың жасайды, оның үшін қолжетімсіз әрекет ферментінің.

Стереохимическая ерекшелігі ферменттер негізделген болғанымен оптикалық изомерных L — және D-нысандарын немесе геометриялық (цис — және транс- ) изомерлер химиялық заттар. «Мәселен, белгілі оксидазы L — және D-амин қышқылдары, бірақ табиғи ақуыз табылған тек L-амин қышқылдары. Әр түрлі оксидаз ғана қолданылады және өзінің спецификалық стереоизомер.

Көрнекі мысал стереохимической ерекшелігін болып табылады бактериялық аспартатдекарбоксилаза, катализирующая отщепление 2-тек қана L-аспаргиновой қышқылы айналдыру және оны L-аланин» [1].

4. Регулируемость ферменттер биокатализаторлар ретінде. «Арқылы реттеу ферментативті аппаратының жүзеге асырылады үйлестірілуі барлық метаболиттік процестердің уақыт пен кеңістікте бағытталған ойнату тірі материяның қолдау тұрақтылық жасушаішілік ортаның, құрылғы өзгермелі сыртқы жағдайларға» [2].

5. Термолабильность ферменттер. Химиялық реакцияның жылдамдығы температурасына байланысты, сондықтан катализируемые ферменттермен реакциялар, сондай-ақ сезімтал өзгерістерге температура. Алайда салдарынан белок табиғатты ферментінің жылу денатурация температура болады төмендетуге тиімді концентрациясын ферментінің тиісті төмендеуімен реакция жылдамдығын. Осылайша, термолабильность, немесе сезімталдық арттыру температура бірі болып табылады тән ферменттердің қасиеттерін күрт отличающих оларды бейорганикалық катализаторлар. Кезінде 100 0 С-барлық дерлік ферменттер өзінің белсенділігін жоғалтады («magnum», әлбетте, тек бір фермент бұлшық ет тіні — миокиназа, шыдайды қыздыру 100-ге дейін 0 С). Төмен температурада (0 0 С-тан төмен) ферменттер, әдетте, жоқ бұзылады, бірақ олардың белсенділігі жоғары құлайды дерлік нөлге дейін. Барлық жағдайларда мәні бар әсер ету уақыты тиісті температура. Қазіргі уақытта пепсина, трипсина және басқа да бірқатар ферменттердің дәлелденген болуы тікелей байланысты жылдамдығы арасындағы инактивация ферментінің және дәрежесімен денатурации ақуыз. «Термолабильность ферменттердің белгілі бір әсер етеді концентрациясы субстраттың, ортаның рН және басқа да факторлар.

6. Тәуелділік ферменттерінің белсенділігін желтоқсандағы рН орта. Ферменттер, әдетте, неғұрлым белсенді шегінде тар аймағының сутекті иондардың шоғырлануын, тиісті жануарларға арналған маталар негізінен выработанным процесінде эволюция физиологиялық мәні ортаның рН 6.0 — 8.0. рН-оптимум әрекет ферменттер жатыр шегінде физиологиялық мәндері. Жауап: пепсин, рН-оптимум тең 2.0. Бұл пепсин құрамына кіреді: асқазан сөлінің құрамында еркін соляную қышқылы жасайды оңтайлы кислую сәрсенбі күні үшін осы ферментінің. Екінші жағынан, рН-оптимум аргиназы жатыр қатты сілтілі аймағында (шамамен 10.0); мұндай ортаның жоқ бауыр жасушаларында, демек, in vivo аргиназа жұмыс істейді, сірә, өзінің оңтайлы аймағында рН ортасының. Өзгерістерінің әсері рН ортаның молекулалары ферментінің жасалады әсері жай-күйі және иондану дәрежесі қышқыл және негізгі топтары (СООН-тобы дикарбоновых амин қышқылдары, SH-тобының цистеин, имидазольного азот гистидиннің жəне т. б.). Әр түрлі мәндері рН ортасының белсенді орталығы болуы мүмкін ішінара ионизированной немесе неионизированной нысан әсер ететін үшінші құрылымы ақуыз және, тиісінше, қалыптастыру белсенді фермент-субстратного кешені. Сонымен қатар, мәні және жағдайы иондану субстраттар мен кофакторов.

Алу ферментті препараттарды.

Алу үшін ферментті препараттарды қолданады микроскопиялық саңырауқұлақтар, сонымен қатар бактериялар мен ашытқы. Кейде алуға техникалық ферменттік препараттың бітпейтін жүргізуге ферменттеу процесін, мысалы, спирт өнеркәсібінде қанттандыру үшін крахмал пайдаланылады сұйық мәдениетін Aspergillus niger. Кейіннен оны қосады сұйық түрінде саны 10-12% осахареваемому затору. Алайда белсенділігі ферменттер культуральной сұйықтық тез төмендейді. Сондықтан кеңінен зейнет ақы алуға құрғақ техникалық ферментті препараттарды.

Техникалық ферменттер препараттары. Кешенді амилолитический ферментті препарат алады өсіру арқылы зең саңырауқұлақтардың қатты қоректік ортада кейіннен кептіру және измельчением алынған массасы. Неғұрлым белсенді препарат ферментінің жолымен алады экстракция осындай «грибного жармасын», кейіннен выпариванием және кептіру. Одан да белсенді ферменттік препараттар бөлуге болады бірі культуральной сұйықтықты тұндыру амилаза ацетоном және одан әрі кептіру коагулятом температурада 27-27 0 С тұндыру Үшін ферментінің жиі пайдаланады және аммоний сульфаты. Алдын ала культуральную сұйықтық выпаривают температурасы 40 0 С-дан 40%-дық мазмұны құрғақ заттар. Коагулят кептіреді бірге толтырғыштар.

Кешені ферменттер протеолитического және амилолитического қолданылу алады кезінде көмек көрсету мәдениет Bacillus subtilis. Бұл аэробты, грамм оң, қозғалмалы таяқша. Осы бактериялардың тән өте бай кешені гидролитических ферменттер. Қоректендіру көзі ретінде олар пайдалана алады белоктар, көмірсулар, спирттер, органикалық қышқылдар. Bacillus subtilis насихаттайды ретінде әдісімен беттік культивирлеу отрубях, сондай-ақ сұйық ортада ерекше құрамын әдісі бойынша тереңдік өсіру.

Целлюлолитические ферменттік препараттар. Өндірісі целлюлаз пайдалануға негізделеді культуры гриба Trichoderma viride. Қазіргі уақытта алу тәсілдері целлюлаз » глубинной мәдениет көздейді өсіру микроорганизмдер-продуценттерінің целлюлаз қоректік ортада құрайтын көзі ретінде көміртегі, әдетте, тазартылған целлюлоза немесе құрамында, оның табиғи субстраты. Бірақ алу целлюлазы пайдалана отырып, негізгі компонент ретінде, қоршаған табиғи целлюлоза (мысалы, ағаш үгінділері) ұласады бірқатар технологиялық қиындықтар. Неғұрлым ұтымды пайдалану, қоректік ортаның құрамында ерігіш «индуктор». Мұндай қоректік ортамен мүмкін сүт сарысуы, негізгі құрамдас бөлігі болып табылады лактоза (алдын-ала от сүт сарысуының туғаннан ақуыз). Ретінде продуцента пайдаланылуы мүмкін aspergillus Trichoderma lignorum алуға мүмкіндік беретін бүкіл кешені целлюлолитических ферменттер үшін қажетті ыдырату табиғи целлюлозусодержащих субстраттар.

Жалпы әдістері ферменттерінің белсенділігін анықтау.

Бұрын ішкі қосымша бөлу ферментінің, сайлау қажет, мұқият пысықтау әдісі белсенділігін анықтау бақылауымен жүргізілетін таңдау ең тиімді тәсілдерін тазалау ферменттер, содан кейін және орындау дәйекті кезеңдерін, оның препаративного алу. Ферменттің белсенділігі өзгереді, әр түрлі жағдайларда реакция және тәуелді температура, ортаның рН, концентрация субстраттар мен кофакторов. Ескере отырып, бұл кезде ферменттің белсенділігінің әр түрлі сатыларында тазалау қажет қатаң сақтауға бірдей. Мүмкіндігінше шектелмей ұйғарымымен белсенділікті бір-бір қандай да бір әдісі. Саны субстрат, превращаемого жағдайында анықтау бойынша тест ферменттің белсенділігінің болуы тиіс пропорционалды соңғы және уақыты инкубациялау. Ондай үйлесімділік, онда белсенділігі бойынша есептейді алдын ала построенному калибровочному кесте отражающему тәуелділігі реакция жылдамдығын санынан бірлік ферментінің. Қашан барысы реакция нелинеен уақыт анықтау керек бастапқы реакция жылдамдығы (тангенсу көлбеу бұрышын жанама бастапқы отрезку қисық айналу). Бұл үшін оңай қолдануға, мұндай әдістері белсенділігінің өзгеру мүмкіндік беретін үздіксіз барысына айналдыру уақыты: спектрофотометрические әдістері, потенциометрические, полярографические және т. б. жылдамдығын өлшеу Үшін ферменттік реакциялар таңдап, буфер, ол тежейді зерттеу белсенділігі және ұстауды қамтамасыз етеді ерітіндінің рН-жақын оңтайлы үшін осы ферментінің. Реакцияны жүргізеді температурада орналасқан көп жағдайда шегінде 25-40 0 С. зерттеу Кезінде ферменттердің қатысуын талап ететін кофакторов (иондар металдар, коферментов және т. б.), олардың концентрациясы төмендеуі мүмкін қарай тазалау ферментінің, реакционную қоспасы қосу қажет жетіспейтін кофакторы, мысалы металл тұздары, АТФ, НАДФ және т. б. Сондай-ақ анықтау үшін ферменттер белсенділігінің енгізеді тұрақтандырғыштар құрамына тәжірибелі қоспалар. Көптеген жағдайларда қосу желатин, альбумин және басқа да қоспаларды алдын алады денатурацию ферментті ақуыз.

Спектрофотометрические әдістері. Спектрофотометрические әдістері негізделген поглощении жарықтың белгілі бір учаскелерінде спектрін көптеген қосылыстармен болып табылатын белсенді топтары ферменттердің субстраттары болып немесе өнімдерімен реакциялар. Ереже максимум сіңіру белгілі бір толқын ұзындығы бар болуымен анықталады зерттелетін материалда белгілі бір топтар — аналитикалық формалары. Өлшеу үшін спектрлерін арнайы құралдар қолданылады — спектрофотометры, фотометриялық абсорбциометры және т. б. Бұл әдіс ерекшеленеді жоғары сезімталдығы, мүмкіндігіне орай жылдам анықтау, шағын жұмсалуын ферментінің және реактивтер және мүмкіндік береді қадағалап ағыммен реакция уақыты. Бұл үшін реакционную қоспасы салынған кювету, вставленную » термостатируемый кюветодержатель. Арқылы аз уақыт ішінде қосқаннан кейін, ферменттің (немесе субстрат) және жылдам араластыру өлшейді сіңіру толқын ұзындығында, тән үшін пайдаланылатын субстрат немесе түпкілікті өнім, пайда болатын осы реакциялар. Көмегімен спектрофотометрического әдісін қалай өлшеуге тікелей концентрациясын кейбір ферменттердің (кейін жеткілікті тазалау) шамасы бойынша тән сіңіру максимумдар берік байланысты коферментов (простетических топтар). Болуы керек, еркін түрде таңдалған бірлікке ферментінің көмегімен болатын еді сандық білдіруге тазалығы мен белсенділігі әр түрлі фракциялардың. Көп жағдайларда таңдау бірлік байланысты сайланатын әдісін анықтау. Жағдайда спектрофотометрического әдісін осындай бірлігі қызмет саны ферментінің, ол тудырады, белгілі бір өзгеріс оптикалық тығыздығы белгілі бір уақытта осы шарттар кезінде тәжірибе; егер анықталады өнім реакция, онда бірлігі саны болады ферментінің, ол тудырады, білім белгілі бір санын заттар минутына, және т. б. Сол кезде меншікті белсенділігі ферментінің болып табылатын өлшем тазалық ферментті препараттың білдіреді саны бірлік 1 мг заттар (ақуыз).

Айқындау мақсаттары үшін ферменттер пайдаланылуы мүмкін тек өлшеу сіңіру жарық, бірақ сондай-ақ өлшеу флюоресценции — спектрофлюорометрические әдістері. Мұндай анықтау ферменттің белсенділігінің бірқатар жағдайларда сезімталдығы бойынша асып түседі спектрофотометрические әдістері бір тәртібі шамалар. Кейбір коферменттер және субстраты ие күшті флюоресценцией. НАД және НАДФ қалпына келтірілген жай-күйі бар күшті флюоресценцию және флюоресцируют » окисленном жай-күйі. Сондықтан спектрофлюорометрию пайдаланады зерделеу үшін кинетика және механизмі никотинамидных және флавиновых ферменттер.

Колориметриялық (фотометриялық) әдістері. Негізінде осы әдістерді жатыр өлшеу көмегімен көзбен шолып немесе фотоэлектрлік колориметра окрашенного өнім кезінде пайда болатын өзара іс-қимылы субстрат немесе өнімнің қолданылу ферментінің тарапынан ерекше реактивтермен, олар, әдетте, қосылады тіркелген тәжірибелік сынама, взятую тоқтағаннан кейін ферменттік реакциялар. Бұл әдістер өте әр түрлі болып табылады. Әзірленген сандық әдістері, негізделген биуретовой реакциялар кезінде оның құрамы ақуыз, әлбетте керек етпей айқындау нәтижелері, т. б. бұл реакция пептидные байланысты емес, бүйір топ белке. Әдісі Горнелла және тең авторлардың негізделген өлшеу жолақтар сіңіру саласындағы 550-650 нм, анықтау үшін пайдаланылады айтарлықтай мөлшерін (1-10 мг) ақуыз сынамада. Ұсынылады биуретовые микрометоды негізделген поглощении ультракүлгін мыс-белковыми кешендермен: олар мүмкіндік береді анықтау 0.1 — 2.0 мг ақуыз сынамада. Саны небелковых заттар әсер етуі мүмкін анықтау арқылы биуретовой реакция, көп емес, бірақ түзетуге болатын заттар бар жоғары концентрацияларда (аммоний тұздары, сахароза). Неғұрлым бағалы болып табылады фотометрлік әдістері, мүмкіндік беретін қадағалауға уақыт барысын ферменттік реакция жоқ, оның тоқтатылуын өзгерту бойынша бояу хромогенного субстрат немесе қосылған индикатор. Әдісі Фолина және Чиокальто, ұсынылған анықтау үшін белок, негізделген хромогенной табиғаттағы кейбір бүйірлік топтар амин қышқылдары, сондай-ақ қатысуымен » ақуыз пептидных байланыстар. Бұл әдіс ие сезімталдығы жоғары (сынаманы жеткілікті 0.01 — 0.1 мг ақуыз), бірақ көптеген ақуызсыз заттар кедергі анықтау.

Қазіргі уақытта анықтау үшін белок кеңінен пайдаланады өлшеулер қарқындылығы сіңіру кезінде жарық 280 нм, ол негізделген қатысуымен » белке хош иісті амин қышқылдары. Саны осы амин қышқылдарының түрлі ақуыз различно және ,демек, қарқындылығы неодинакова. «Кювете қалыңдығы 1 см у ерітіндісін, құрамында 1 мг «орташаланған» ақуыз 1 мл, оптикалық тығыздығы тең 1 кезінде толқын ұзындығы 280 нм. Нуклеин қышқылын жұтып кезінде 280 нм, бірақ жасауға болады түзетуді олардың қатысуы жүргізе отырып, өлшеу және 260 нм және 280 нм. Өте маңызды жылдамдығы ферменттердің белсенділігін өлшеу. Сол жатады өлшеу санын құрғақ қалдықтың немесе белок. Осылайша көреді жылдам анықтау әдісі ақуыз арқылы өлшеу шамасын сіңіру 280 нм. Выигранное уақытта маңыздырақ, сонымен қатар, меншікті сіңіру бөлінетін ақуыз кейде айтарлықтай ерекшеленеді орта шамасын сіңіру қоспалар белоктар қатысқан бастапқы материалда.

Манометрлі әдістері. Бұл әдістер айқындау кезінде пайдаланылады ферменттің белсенділігін жағдайларда зерттелетін реакциялар компоненттерінің бірі орналасқан газ тәрізді күйі. Мұндай реакцияларға жатады, негізінен, сол байланысты процестерді тотығу және декарбоксилдену, сопровождающимися жұту немесе бөлу оттегі және көмірқышқыл газы, сондай-ақ реакциялар, бөлу немесе байлау газ жүреді, нәтижесінде өзара іс-қимыл өнімдерін ферментативті айналдыру с добавленным жүйесіне реактивом. Реакцияның өту барысын уақыт жүргізіледі арнайы құралдарда — манометрических аппараттарда Варбурга.

Басқа да әдістері. Мұнда жатады ауқымды бірқатар әдістерін қамтитын поляриметрию, вискозиметрию, потенцио — кондуктометрические өлшеу және т. б. Сондай-ақ, белсенділігін анықтау орындауға болады, әдістерін пайдалана отырып, хроматография және электрофорез қағазда. Бұл әдістер высокочувствительны және ерекше болып табылады, бұл олардың көптеген жағдайларда алмастырылмайтын; олар едәуір қысқартуға мүмкіндік береді шығыны ферменттің белсенділігін өлшеу, бірақ әрқашан қолдануға байланысты ұзақтығы заттардың бөліну процесінде хроматография және электрофорез).

Арнайы әдістері белсенділігін анықтау пепсина және папаина. Пепсин және папаин жатады бірі көптеген топтар ферменттер — протеолитические ферменттер (протеаза). Олар класына тиесілі гидролаз, ішкі сыныбы пептидгидролаз және катализируют расщепление белоктар және полипептидов сәйкес уравнением :

R 1 CONHR 2 + H 2 O + R 1 COOH + H 2 NR 2 ,

R 1 және R 2 — қалдықтары амин қышқылдары, ди — немесе полипептидтер.

Яғни, протеаза катализируют расщепление пептидной байланыс ѕCOѕNHѕ .

Енді сәл ары-қарай оқу пептидгидролазах.

Ішкі сыныбы пептидгидролаз бөлінеді келесі топтар:

1. аминопептидазы (a-аминоацилпептидгидролазы) катализируют гидролизі полипептидов жері бойынша пептидной байланыс орналасқан жанында еркін аминной тобы.

2. карбоксипептидазы (пептидиламинокислотные гидролазы) катализируют расщепление полипептидов жері бойынша пептидной байланыс орналасқан жанында еркін гидрокси тобы.

3. дипептидазы (дипептидгидролазы) катализируют гидролитикалық расщепление еркін амин.

NH 2 CH 2 CONHѕCH 2 ѕСООН + H 2 O ® 2CH 2 NH 2 COOH

Дипептидазы расщепляют тек осындай пептидные байланыс, көршілес отырып бір мезгілде орналасқан бос карбоксильная және амин топтары. Үлкен әсері жарияланған дипептидаз көрсетеді болуы a-сутегі атомдар, қолындағы атомынан байланысты еркін карбоксильной және аминной топтары. Ауыстыру кезінде осы атомдар басқа топтармен ферменттердің белсенділігі төмендейді немесе мүлдем жоғалады.

4. протеиназы — (пептидилгидролазы) гидролизуют тікелей белок. Бұл кезде түзілетін полипептидтер және бос аминқышқылдары. Осы топта протеиназ принадлежит пепсин, трипсин, химотрипсин, папаин, т. б. қолданылу барысында ферменттердің арналған субстраты шешуші рөл атқарады құрылымы молекулалардың субстрат (тиісті бөлігі молекулалардың субстрат) жүргізілетін алшақтық. Сипаты ыдырау ақуыз молекулалары арналған пептидтер мен амин қышқылдары байланысты табиғат субстрат және сыртқы жағдайлар (рН, температура және т. б.). Ретінде ақуыз субстраттарды қолданады желатин, гемоглобин, казеин, сарысулық альбумин.
Әдістері протеолитикалық ферменттердің белсенділігін анықтау

Модификационный әдісі. Модификационный әдісі қолданыла отырып, субстрат казеин негізделген жылдамдығын анықтау ферменттік гидролиз реакцияның субстрат әсерінен зерттелетін протеолитикалық ферменттердің ұсталатын материалда, алынған талдау. Реакция жылдамдығы анықтайды саны бойынша пайда болған амин қышқылы — тирозин (a -амин-b -оксифенилпропионовая қышқылы және триптофан (a -амин-b -индолилпропионовая қышқылы), олар белгілейді колориметрической реакциясы с реактивом Фолина. Бұл әдіспен анықтайды көрсетілген амин қышқылы ретінде еркін және байланысқан жай-күйі.

Саны бойынша тирозин және триптофан ұсталатын қазақстан гидролизате санын анықтайды превращенного ақуыз процесінде ферменттік реакциялар есебінен ұстау белке 6% тирозин және 1.8% триптофан). Есептеудің белсенділігін протеолитикалық ферменттердің положена тәуелділік дәрежесін гидролиз ақуыз санының бірлік ферменттің белсенділігін енгізілген ферментативную реакция. Негізінде бұл тәуелділікті кестесі жасалады.

Жатқызып саны енгізілген реакциясын бірлік ферменттің белсенділігінің әсеріне 1 г препаратты анықтайды, оның белсенділігі. Есептеу үшін тікелей, изображенной кестеде құрайды, есептік теңдеуі.

Бірлігіне протеолитической белсенділігін қабылданды саны қандай ферменттің, ол физиологиялық 30 минут гидролизі 1 г ақуыз қабылданған жағдайында өнімдерге дейін, осаждающихся трихлоруксусной қышқылы. 1г 25% — ын құрайды алынған » ферментативную реакцияны, ақуыз.

Протеолитическая белсенділігі сипатталады бірліктердің санымен ферменттің белсенділігін ұсталатын 1 г препаратты қатты жартылай немесе 100 мл сұйық материалдар. Әдісі талдауға арналған тазартылған ферменттік препараттар саңырауқұлақ текті және жартылай өнімдер, получающихся, оларды өндіру.

Анықтау пепсина бойынша Ансону және Мирскому. Бұл әдіс келесі принциптерге негізделген. Гемоглобин жатады әсеріне пепсина, қалған гемоглобин осаждают трихлоруксусной қышқылы. Аминошайырлар, фенольды шайырлар қасиеттері қалдық (тирозин) айқындалатын фотометрически пайдаланады шарасы ретінде ферменттің белсенділігін.

Субстрат ретінде қызмет етеді 2%-тік ерітіндісі гемоглобин 0.06. ғ. к. ерітіндідегі тұз қышқылының 5 мл-субстрат дейін қыздырады 25 0 С, киіп 1 мл ерітіндінің ферментінің қалдырады, в течении 10 мин, оған 10 мл-0.3. ғ. д. ерітіндінің трихлоруксусной қышқылы, белсенді взбалтывают, сүзгіден өткізеді және 5 мл сүзінді су отливают » өлшеу колбаға 25 мл. Мұнда приливают 10 мл 0.5. ғ. к. күйдіргіш натр ерітіндісін және 3 мл фенольного реактивті енгізу (реактив Фолина-Чиокалтеу араластырады алдын ала екі су көлемі) және жеткізеді дейін сумен таңбалар. Бірнеше минуттан кейін боялған ерітінді фотометрируют қатысты стандартты ерітіндінің құрамында 0.0008 мэкв тирозин 5 мл 0.2. ғ. д. тұз қышқылы ерітіндісін (к раствору қосады 0.5% формальдегид ретінде антисептик). Болдырмау үшін ықтимал қателердің қояды бос тәжірибесі. Бірлік пепсина білдіреді » миллиэквивалентах тирозин (6 . 10 -4 дейін 11 . 10 -4 ): бірлік пепсина = миллиэквиваленты тирозин х1.47.

Анықтау протеолитикалық ферменттердің бойынша Муру және Штейну. Әдісі негізделген оның құрамында a -аминогруппу амин қышқылдары береді с нингидридом окрашенную производную — дикетогидриндилидендикетогидриндамин, сондай-ақ альдегид-амин қышқылдары және углекислоту.

Боялған өнімге ие, өзіне тән максимумом сіңіру 570 мм , ал қарқындылығы бояу санына байланысты амин қышқылдары. С пролином және оксипиролином реакция ағады, өзге бағытта, ал максимум сіңіру алынатын бұл ретте окрашенного өнімнің орналасқан кезде 440 мм .

Инкубацию ферментінің ыңғайлы жүргізуге өлшеуіш колбочках 5 мл, араластырады және уравновешивают тұрақты температурада су моншасында барлық компоненттері қоспағанда ферментінің. Содан кейін фермент қосады, ерітіндіні араластырады және зерттеу үшін сынамалар алады. Үшін кинетикалық өлшеу концентрациясын ферментінің мүмкіндігінше таңдауға болатындай аликвотные бөлігін еді брать әрбір 5 минут.

Аликвотные бөлігінде сынама алған бірден қосқаннан кейін, ферменттер, содан кейін тиісті интервалдары, қосады фотометриялық пробиркаға 2 мл реактивті енгізу нингидрида — бұл сол обрывает реакция. Содан кейін қоспасы 20 мин. қыздырады су моншасында; алынған бояу тұрақты кем дегенде 24 сағат. Орташа қате талдау кезінде қайталанған сынама құрайды ± 2%. Кейін араластыру қайнаған қоспалары сынамалар мен нингидрида 10 мл қоспаны тұратын тең су көлемін. ғ. к. пропанола, бояудың қарқындылығы анықтайды спектрофотометре Колемана кезінде 570 мм .

Калибрлеу үшін пайдаланады тұрақты количествами стандартты амин қышқылдары, құрамында реакция компоненттері. Көмегімен калибрлеу қисық салынған әрбір зерттелетін амин қышқылдары, қарқындылығын өлшеу бояу (қатысты бақылау колбе) пересчитывают » миллимоли. Бөлген кезде, осы шамалардың миллимоли субстрат, пайдаланылған процесінде реакциялар табуға пайызы гидролиз.

Құру калибрлеу қисық болдырмайды қателіктер болып жатқан сапалық айырмашылықтар реакция амин қышқылдары түрлі-түсті реактив. Дейін оптикалық тығыздығын 0.1 шамасы арасында тәуелділікті, сіңіру және саны субстрат сипатқа сызықтық сипаты.

Жаңадан өндірілуін құрайды ± 3%. Мешающее әсері аммоний, аминдер және басқа да заттардың ұсталатын биологиялық материалда және беретін түрлі-түсті реакцияны бастап нингидридом шығарылады, тиісті бос сынама. Талдау салыстырмалы түрде оңайлатылады, қашан оқиды протеолитические фермент, субстраттары болып табылатын пептид, құрамында бос да көп амин топтары барлар. Бұл жағдайда, барлық пайда болатын бояу толығымен тиесілі освободившуюся амин қышқылы.

Микрометод белсенділігін анықтау протеиназ А. П. Алексеенко. Ұсынылатын микрометод белсенділігін анықтау протеолитикалық ферменттер негізделген өлшеу ұстау аргининнің пептидах босаған кезде гидролиз протеиназами белок субстраттар. Мазмұны аргинин анықтайды көмегімен тұрақтандырылған және жетілдірілген Сакагучи реакциясы (хроматограмму батырады 0.1% ерітінді 8-гидроксихинолина » ацетоне, ауада кептіреді, ерітіндісімен бүркеді 0.2 мл Br 2 100 мл 0.5 М NaOH; аргинин және басқа да гуанидины береді қызғылт-қызыл дақтар, тауромицин және гликоциамин — тек уақытша болады) анықтауға мүмкіндік беретін мазмұны аргинин ерітінділерде трихлоруксусной қышқылының кейін тұндыру және жою ерімейтін белоктар. Біле мазмұны аргининнің белковом субстрате және анықтай отырып, оның саны көшкен ерітіндіге пептидах, есептеуге болады пайызы гидролиз белоктық субстрат изучаемыми протеиназами. Бұл тұрады басты артықшылығы әдіс, өйткені әдіс Ансона мүмкіндік бермейді есептеу пайызы ақуыз гидролиз, атакуемого протеолитическими ферменттерге. Барлық қолданыстағы әдістерін әдісі ғана Мұра және Штейн анықтауға мүмкіндік береді пайызы белок гидролиз субстраттар, бірақ ол шектеулі түрде қолдану қажет, алдын ала толық қышқыл гидролиз ретінде белок-субстрат, сондай-ақ пайда болған пептидтер. Ұсынылған әдістеме калибрлеу қисығы бойынша құрылады ерітіндісі еркін аргинин. Кіріспе реакциясын пептидті және ақуыздар түрінде олардың биуретовых кешендерін арттырды сезімталдық реакциялары Сакагучи қалдықтарымен аргинин мен жасады, оның осындай сезімтал, еркін аргинин. Ретінде ақуызды субстрат пайдаланады классикалық субстрат — гемоглобин және окисленный бойынша Сангеру лизоцим. Бұл низкомолекулярный ақуыз қамтитын 12.7% аргининнің тамаша расщепляется пепсином (ұмтылмайды 30-ға жуық байланыстар).

Кіріспес бұрын, анықтау ферменттердің зерттелетін тін субстратах қажет:

1. Анықтау тәуелділігі белсенділігін желтоқсандағы рН және таңдау оңтайлы реакция орта көріністері белсенділігін оқылатын ферментінің.

2. Графигін салу байланысты ферменттің белсенділігінің, оның ішінде инкубация бастап субстрат. таңдау үшін сол мерзімдерде, инкубация кезінде сақталатын сызықтық шамасы арасында тәуелділікті, ферменттің белсенділігін және уақытпен оның инкубация.

3. Анықтау тәуелділігі шамасын белсенділігінің концентрацияға ақуыз сынамада. Таңдау мұндай концентрациясы ферменттер, олардың шамасы ферменттің белсенділігін еді пропорционалды оның концентрациясы. Ескеру қажет, бұл мата сығындысынан және биологиялық сұйықтықтарда қатыса алады протеолитикалық ферменттердің ингибиторлары. Еріту кезінде сынама олардың концентрациясы төмендейді , ал протеолитикалық — артады. Анықтай отырып, «фактор» өсіру, бір мезгілде таңдай отырып, оңтайлы шарттарын анықтау үшін протеолитической белсенділігін анықтау және болуы ингибиторы.

4. Кезде ферменттің белсенділігін қажет жұмыс істеу кезінде тұрақты жылдамдықпен ферменттік реакциялар, қол жеткізілетін толық толтыру ферментінің субстрат, деп аталатын ең жоғары жылдамдығын ферменттік реакциялар. Әрбір жеке жағдайда ең жоғары жылдамдықты табу қажет эксперименттік, измерив белсенділігі препараттың әр түрлі концентрацияда субстрат тұрақты концентрацияда ақуыз және уақыт инкубациялау.

Белсенділігін анықтау протеиназ бойынша белковому субстрату.

— 0.5 мл субстрат тиісті буферном ерітіндісіне қосады 0.5 мл сынама құрамында фермент (сығындысы, биологиялық сұйықтық), инкубациялайды белгіленген тәжірибелі жолымен , содан кейін белоктар сынамада осаждают 5 мл 10% трихлоруксусной қышқылы. Туғаннан тұнба центрифугалау, ал надосадочную сұйықтық (ТСҚ-центрифугат) жатады, одан әрі өңдеу. Бақылау сынамасы — сынама, реактив қосылды кері тәртіпте: 3 мл 10% ерітінді ТСҚ қосады 0.5 мл ерітіндінің құрамында фермент және 0.5 мл субстрат. Ұсынылады қоюға сынамаға арналған автолиз субстрат: 0.5 мл субстрат қосады 0.5 мл прокипяченного ерітіндісін, құрамында фермент, инкубациялайды бірге тәжірибелі сынамалары және тежелген ТСҚ.

Мазмұнын анықтау аргининнің ТСҚ-центрифугантах бойынша модификацияланған Сакагучи реакциясы. — 0.5 мл ТСҚ-центрифуганта қосады 0.5 мл 2.5 мМ ерітінді CuSO 4 , 0.5 мл 5 Н. КОН, 0.5 мл ерітінді ДХН (2,4-дихлор-1-нафтол). Ерітінді встряхивают енгізеді 0.5 мл гипобромита натрий, лезде пайда болады ашық-қызғылт бояу. Ерітінді встряхивают және 20-30 секунд стабилизируют сынама қосылған 0.2 мл ерітінді 2-тиогликоля (болдырмау үшін бұзылуы окрашенного өнімнің мол гипобромита натрий. Қосқаннан кейін 2-тиодигликоля да сынамалар сияқты тәжірибелі және бақылау, пайда желтоватое бояу есебінен жанама өнім арасындағы реакциялар артық ТСҚ және гипобромита натрий. Жанама өнім сондай-ақ, тұрақтанады 2-тиодигликолем. Оптикалық тығыздығы сынама өлшенеді спектрофотометром кезінде 520 нм » кювете қалыңдығы 1 см.

Белсенділігін анықтау протеиназ бойынша реакциялар реактивом Фолина. — 0.5 мл, сол ТСҚ-центрифуганта қосады 0.5 мл 2.5 мМ ерітінді CuSO 4 , 4 мл 0.5. ғ. к. ерітінді NaOH және 1.5 мл разбавленного үш есе реактивті енгізу Фолина. 30 минуттан кейін өлшейді арналған спектрофотометре оптикалық тығыздығы 760 нм

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *